江苏原位杂交制作 思特进

间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高6辛，生物素。结合地高6辛抗6体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高6辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高6辛抗6体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高6辛抗6体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免6疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。

通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。

就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。

Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。

杂交技术zui重要的因素之一是选择zui适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即zui适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

zui适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35℃)